目的　增强脐血CD34⁺造血细胞对化疗药物的耐药表型，探讨逆转录病毒介导的基因转移效率和耐药基因特性，以及在脐血造血干细胞保护性基因治疗中的作用和意义。方法　应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中获得编码六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(O⁶-methylguanine-DNA-methyltransferase,MGMT)cDNA；利用基因重组技术，将其克隆于pGEM-T质粒载体并构建了逆转录病毒载体G1Na-MGMT；应用脂质体LipofectAMINE基因转移法将后者导入GP+E86和PA317病毒包装细胞，以卡氮芥1，3-Bis(2-Chloroethyl)-1-Nitrosourea(BCNU)加压筛选后的阳性克隆上清经乒乓效应后继而感染脐血CD34⁺细胞。应用PCR，Southern Blot，RT-PCR，Northern blot,Western Blot及MTT法检测MGMT基因在脐血CD34⁺细胞中的转移和表达。结果　酶切鉴定及DNA测序证实了MGMT cDNA克隆的正确性，脂质体介导方法成功将其导入病毒包装细胞，BCNU加压筛选和乒乓感染法使病毒效价达1.6×10⁶CFU/ml,逆转录病毒载体介导的MGMT基因在脐血造血干细胞中获得了有效转移和表达。转MGMT耐药基因脐血造血干／祖细胞对BCNU的抗药性较对照组提高了4倍。结论　DNA修复蛋白MGMT基因的克隆并导入脐血造血干／祖细胞可以明显提高靶细胞的耐药性。
　　【关键词】　六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因；　逆转录病毒载体；　造血干细胞；　基因疗法；　脐血

长期以来，耐药性作为肿瘤化疗失败的主要原因，被认为是必须克服和排除的负面因素。目前一种新的基因治疗策略，即将耐药基因导入正常骨髓造血干细胞，加大造血细胞与肿瘤细胞克隆之间对化疗耐受性的差别，以便施行大剂量化疗而最大限度发挥化疗疗效，保护和及时恢复造血功能，可望成为克服肿瘤耐药的新手段^［1，2］。脐血作为造血干细胞移植的来源之一，因其具有较强的增殖潜能，无肿瘤细胞污染，并易于为逆转录病毒载体所转导等优势倍受人们注目。我们从人肝组织克隆了六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O⁶-methylguanine-DNA-methyltransferase,MG-MT)基因，以脐血CD34⁺细胞为靶细胞，将该基因导入并对由此产生的抗卡氮芥〔1，3-Bis(2-Chloroethyl)-1-Nitrosourea,BCNU〕效应进行了研究。

1　材料和方法

1.1　实验材料及脐血CD34⁺细胞的分离
1.1.1　主要试剂　WizardTM DNA clear-up试剂盒，pGEM-T-Easy载体，T4DNA连接酶和其它工具酶为Bio-lib和MBI公司产品，LipofectAMINE、胎牛血清、DMEM、细胞因子、RNA抽提试剂盒TRIzol为Gibco-BRL公司产品，α-³²P-dATP和MGMTAb-1(MT-3.1)分别购自美国杜邦及NEOMarker公司，BCNU，Polybrene,X-Gal,IPTG,MTT为Sigma公司产品。
1.1.2　细菌和细胞株　大肠杆菌TG1，鼠源单向型GP+E86，双嗜型逆转录病毒包装细胞PA317，小鼠成纤维细胞NIH3T3为本室传代保存。
1.1.3　脐血CD34⁺细胞的采集和分离　用磁珠分离系统MACS分离CD34⁺细胞，即抗CD34抗体与细胞悬液1∶5混匀，4℃孵育20 min，1∶5加入羊抗鼠免疫磁珠，8～10℃孵育15 min后洗涤，制成单细胞悬液，标记细胞通过置于磁场的分离柱，洗脱去除CD34^-细胞，将分离柱移出磁场，加压洗脱，收集CD34⁺细胞，流式细胞仪测定纯度。标记抗体为FITC结合的鼠抗人CD34单克隆抗体(HPSA-2 CD34)。
1.2　MGMT基因的分离及重组子的构建
1.2.1　MGMT基因的合成　取胆石症患者手术切除的新鲜肝细胞0.5 g，采用TRIzol试剂盒按其说明提取细胞总RNA。采用六随机引物，经MMLV逆转录酶合成cDNA，自行设计引物辅以微机分析。MGMT引物为5′-AAAATGGACAAGGATTGT-GAAA-3′；5′-CATCCGATGCAGTGTTACACG-3′，产物预计为684 bp。反应条件；95℃ 1 min，72℃ 2 min，55℃ 1.5 min，30个循环后产物行2%琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.2　含人MGMT重组逆病毒载体的构建　人MGMT PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用Wizard^TM DNA clean-up试剂盒纯化，得到684 bp的MGMT产物，克隆入pGEM-T载体的EcoR Ⅰ和Spe Ⅰ位点之间。经氨苄青霉素抗性和蓝白斑筛选、扩增、质粒提取后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，以Not Ⅰ酶切pGEM-T-MGMT与G1Na逆病毒载体Not Ⅰ位点。T4 DNA连接酶将MGMT cDNA片段与G1Na框架连接后转化受体菌TG1获得重组逆病毒表达载体G1Na-MGMT，用NotⅠ、SacⅠ、SacⅡ行酶切鉴定。采用ABI PRI SMTM377DNASequencer进行DNA序列分析。
1.3　MGMT重组基因的转染
1.3.1　重组逆转录病毒的体外包装及病毒滴度的测定　取对数生长期的GP+E86包装细胞，以LipofectAMINE介导将G1Na-MGMT导入该细胞。转染前24 h胰酶消化细胞，按1/10细胞接种于3.5 cm平皿中，待细胞融合生长达50%～80%，用2 ml无血清DMEM洗细胞一次后将DNA／脂质体混合液1 ml均匀滴加入培养皿中。5%CO₂37℃全湿培养6 h后补加含小牛血清DMEM 1 ml，混匀，24 h后换成含10%FCS的DMEM培养基继续培养，3 d后取其上清经0.45 μm滤膜过滤，用于感染PA317细胞。分别经BCNU筛选得到抗BCNU的GP+E86和PA317细胞抗性克隆。同时设空载体转导的细胞和未转染细胞作对照。
1.3.2　单向型与双嗜型包装细胞交互感染(乒乓感染法)提高重组逆转录病毒滴度　将单向型包装细胞(GP+E86)重组病毒悬液(Polybrene 8 mg/L)，过滤除菌后加入到24 h前传代并已达50%融合的双嗜型包装细胞(PA317，10⁵/2 ml)。37℃感染2 h，加入新鲜DMEM至polybrene的浓度降至2 mg/L。继续培养48 h，按1∶10传代后分别以BCNU(10～40 μm/L)选择至耐药的双嗜性生长细胞出现。此过程交替反复进行。
1.3.3　重组病毒上清滴度测定　以NIH3T3细胞为靶细胞，用含BCNU(10 μm/L)的DMEM培养基连续筛选14 d，计算细胞克隆数。
1.3.4　重组逆病毒感染CD34⁺细胞　当在DMEM中培养的重组逆病毒生产细胞达70%～80%融合时即换成20% FBS的IMDM培养液，继续培养24 h后收集上清。转染前48 h将人脐血CD34⁺细胞于含有20% FBS，50 ng/ml GM-CSF，50 ng/ml rhSCF，50 ng/ml IL-3，30 ng/ml IL-6的IMDM中预培养，离心弃培养液，将病毒上清及同样浓度的细胞因子及5 μg/ml的鱼精蛋白一并加入，每天换液，连续5 d后收集细胞。
1.4　转染靶细胞中融合基因的鉴定
1.4.1　PCR和Southern blot检测外源基因整合入靶细胞基因组　按常规方法提取转染基因组DNA，并以MGMT引物进行PCR，反应条件同前。另将靶细胞基因组DNA以Not Ⅰ，EcoRⅠ酶解后以MGMT cDNA作为探针进行Southern blot。电泳、转膜、杂交、检测参照文献［3］。
1.4.2　RT-PCR、Northern blot检测转基因靶细胞中MGMT基因转录水平的表达　采用MGMT基因引物，逆转录和PCR反应与上述MGMTcDNA合成方法相同。收集(1～2)×10⁷细胞，用TRIzol试剂提取细胞总RNA，用含甲醛(2.2 mol/L)的凝胶电泳分离RNA样品，紫外灯下测28 S rRNA与18 S rRNA至电泳原孔位置，将RNA吸印转移至硝酸纤维膜(NC膜)，80℃烘烤固定2 h，预杂交4 h后加入变性后的α-³²P-MGMT cDNA继续于42℃杂交20 h，经重复洗膜后置-70℃冰箱放射自显影。
1.4.3　Western blot分析转染细胞MGMT基因表达^［4］　将转染细胞裂解后以1×PBS液透析，Folin-酚法测蛋白含量，表达产物经电泳后转移至NC膜上。经封闭液(5%脱脂奶粉，0.02%叠氮钠，1×PBS，pH=7.4)封闭后加入抗MGMT一抗(MT3.1)孵育4 h后洗涤，加入连接有辣根过氧化物酶的羊抗鼠二抗(1∶500)室温孵育1 h，洗膜，然后用ECL试剂检测。
1.4.4　细胞存活分析　转基因靶细胞对BCNU的敏感性用MTT法测定^［5］。2×10⁵个细胞种植于96孔板，加入BCNU(10～40 μm/L)后37℃，5%CO₂全湿培养48 h，每孔加入新鲜配制的MTT工作液20 μl。37℃培养4～6 h，每孔加入100 μl DMSO。用酶联仪测定每孔在570 nm处OD值，计算IC₅₀值。

2　结果

2.1　人MGMT cDNA基因克隆　用RT-PCR从人肝细胞中克隆得到长为684 bp MGMT cDNA，将该片段与pGEM-T载体连接转化后得到重组质粒pGEM-MGMT。以NotⅠ酶切下MGMT cDNA片段后插入G1Na载体的NotⅠ位点，经SacⅠ、SacⅡ、NotⅠ酶切鉴定为正确连接，经测序分析其序列与文献［6］报道完全一致。
2.2　脐血CD34⁺细胞的分选、纯化　分选前的CD34⁺细胞纯度为2%～7%，分选后可达82%～96%，回收率为72%。
2.3　高滴度产病毒细胞系的建立　将以LipofectAMINE介导转染GP+E86细胞经BCNU筛选后将其上清感染PA317，用上述两株细胞克隆上清交互感染(乒乓感染法)4个周期，分离PA317细胞克隆最高滴度达1.6×10⁶，经筑巢式PCR检测无辅助病毒产生。
2.4　逆病毒载体介导的MGMT基因整合入脐血造血干细胞基因组　提取转染的脐血CD34⁺细胞基因组DNA作模板，经PCR扩增出MGMT阳性条带(684 bp)，对照组细胞则为阴性，用α-³²P-MGMT cDNA与转染的靶细胞基因组DNA杂交(Southern blot)亦显示出阳性条带，表明外源基因已整合入靶细胞基因组。
2.5　RT-PCR和RNA印迹鉴定MGMT基因转录水平的表达　在未转染细胞与G1Na转染细胞中没有检测到MGMT基因的mRNA，说明MGMT在此细胞中无表达；而在MGMT转导的脐血细胞中检测到较强的转录信号，说明该基因在脐血CD34⁺细胞中得到表达(图1，2)。

图1　RT-PCR检测G1Na-MGMT转导脐血CD34⁺细胞中MGMT基因的转录表达
1:100 bpDNA标记；2：RT-PCR扩增G1Na-MGMT转导的脐血CD34⁺细胞中MGMT mRNA
图2　Northern杂交检测转染脐血CD34⁺细胞中转录MGMT mRNA
1、2：转染的脐血CD34⁺细胞；3：阴性对照(CD34⁺细胞/未转染)
图3　Western blot分析G1Na-MGMT转染的PA317和脐血CD34⁺细胞中MGMT基因表达
1：转染的PA317；2：脐血CD34⁺细胞；3：未转染的CD34⁺细胞
Fig 1 Expression of MGMT mRNA detected by RT-PCR in umbilical
cord blood CD34⁺ cells transduced with G1Na-MGMT retroviral
vector 1:100 bp DNA ladder marker; 2:RT-PCR amplified
MGMT mRNA from umbilical cord blood CD34⁺ cells transduced
with G1Na-MGMT retroviral vector
Fig 2 Northern blot analysis of MGMT mRNA in CD34⁺ cells transduced
with G1Na-MGMT 1,2:Umbilical cord blood CD34⁺ cells transduced with G1Na-MGMT;
3: untransduced CD34⁺ cells (none) serves as negative controls
Fig 3 Western blot analysis of AGT protein expression from PA317 and
CD34⁺ cells transduced with G1Na-MGMT retroviral vector 1:PA317
cells transduced with G1Na-MGMT;2:umbilical cord blood CD34⁺ cells
transduced with G1Na-MGMT;3:untransduced CD34⁺ cells

2.6　Western blot分析耐药基因在蛋白水平的表达用MT3.1单抗与转导的细胞蛋白抽提物进行印迹杂交，结果显示转染细胞在22×10³处出现单一条带，对照组为阴性，说明导入宿主细胞内的MGMT在蛋白水平得到表达(图3)。
2.7　转MGMT基因靶细胞对化疗药物BCNU的耐受性　脐血CD34⁺细胞的IC₅₀为4 μm，显示对BCNU十分敏感，转G1Na细胞的为5 μm，对BCNU的敏感性与脐血造血干／祖细胞相似，转MGMT基因脐血造血干／祖细胞对BCNU的IC₅₀为16，是未转染组的4倍，说明MGMT基因表达导致对BCNU的明显抗性。

3　讨论

　　人MGMT基因为编码相对分子质量为22×10³的DNA修复蛋白(AGT)的基因，定位于染色体10q24.33-qter，含207个氨基酸残基。由于AGT能修复化疗药烷基化的鸟嘌呤，因而可阻止DNA交链形成，防止细胞癌变和死亡，故在DNA损伤修复中起重要作用。因此，MGMT活性的高低是决定细胞对亚硝脲类药物产生耐药性的分子基础。肝脏表达较高水平的MGMT，而骨髓造血干细胞表达该基因的丰度很低，因此对亚硝脲类化疗药物较敏感^［7］。我们在国内首次以RT-PCR方法从人肝细胞克隆了MGMT基因。该基因的成功克隆，为将该靶基因导入并整合入造血干细胞进行有效表达、增加细胞对BCNU等药物的耐受性、防止因加大化疗药物剂量导致的骨髓抑制、进而提高疗效奠定了基础。另外，临床上对肿瘤患者长期使用烷基化药物的严重副作用是二次肿瘤的发生^［8］，这也为烷基化转移酶基因作为耐药基因进行抗肿瘤耐药基因的研究提供了理论依据。本结果显示，转染MGMT的脐血造血干细胞对BCNU的IC₅₀比未转染细胞增加了4倍，表明通过逆病毒载体介导的MGMT基因对造血干／祖细胞的转移能传递一定程度的耐药表型。基因转移效率是基因治疗的关键，我们采用造血生长因子联合作用，因SCF可直接作用于造血干细胞和多向造血祖细胞，促进其增殖，对提高基因转移效率有重要意义^［9，10］。本研究结果表明，利用宿主范围不同的包装细胞进行交互感染，可提高原病毒拷贝数至少一个数量级，从而获得较高滴度的逆转录病毒。有关基因导入造血干细胞后能否长期表达、对靶细胞的生理功能有否影响，还有待于进一步实验研究。

基金项目：国家自然科学基金(3970331)和贵州省科学基金(E97-5)
作者单位：王季石（苏州医学院附属第一医院血液科 江苏省血液研究所　215006　现在 上海医科大学华山医院血液内科博士后流动站　200040）
夏学鸣（苏州医学院附属第一医院血液科 江苏省血液研究所　215006）
陈子兴（苏州医学院附属第一医院血液科 江苏省血液研究所　215006）
阮长耿（苏州医学院附属第一医院血液科 江苏省血液研究所　215006）
卢大儒（复旦大学遗传学研究所）
薛京伦（复旦大学遗传学研究所）