T细胞需两种以上刺激信号才能充分活化。 环孢素A(CsA)通过阻断CD3活化通路而产生免疫抑制效应, 本文研究CsA对CD28活化通路的影响。 研究发现以抗CD3单抗和抗CD28单抗共刺激后, 淋巴细胞增殖比以抗CD3单抗单独刺激时显著增强, 且对CsA不敏感, ID50较单独刺激时高4~5倍。 研究表明: CD28通路能提供共刺激信号, 使T细胞充分活化增殖, 并且这一活化通路能对CsA产生抵抗。
Effect of CsA on T cell activation CD28 pathway Zhou Peijun, Tang Xiaod
a, Wang Xianghui, et al. Department of Urology, Shanghai First People'
s Hospital, Shanghai 200080
Abstract T cell activation CD\-3 pathway can be blocked by CsA to pr
oduce immunosuppressive action. The effect of CsA on T cell activation
CD28 pathway was studied. It was found that the proliferation level of l
ymphocytes stimulated with anti-CD\-3 + anti CD\-\{28\} mAbs was obvio
usly increased than those stimulated with anti-CD\-3 mAb only, and cost
imulated lymphocytes were insensitive to CsA with a much high ID50 leve
l. It was concluded that CD28 could provide costimulatory signal to act
ivate T cell completely , and this pathway was resistant to CsA.
Key words T lymphocyte CD28 Cyclosporine A
目前器官移植临床应用的主要免疫抑制剂CsA能通过阻断钙离子依赖的CD3活化通路, 而
产生免疫抑制效应［1］。 但CsA对T细胞活化CD28通路的影响及其临床意义尚在研究中。
我们采用体外实验方法, 初步观察了CsA对CD28通路的影响。
材料与方法
一、 主要试剂: 鼠抗人CD28单克隆抗体(抗CD28单抗)购自Becton-Dickinson公司,
鼠抗人CD3单克隆抗体(抗CD3单抗)购自DAKO公司, CsA为Sandoz公司产品, RPMI 1640培养
基购自Gibco公司。
二、 淋巴细胞分离: 取健康人外周血8ml, 以肝素抗凝。 采用密度梯度离心法分离外周血
单个核细胞(PBMC)。 Hanks液洗涤两次。 台盼蓝计数表明细胞存活率>95%。
三、 淋巴细胞培养: RPMI 1640完全培养液含100g/L(V/V)加热灭活小牛血清, 5万U·
L-1青霉素, 50mg\5L-1链霉素。 以96孔板培养, 每孔加培养液200μl, 含细胞2×105个,
设三复孔。 根据刺激条件不同分两组: 一组以抗CD3单抗500μg·L-1单独刺激; 另一组以抗
CD3单抗500μg·L-1+抗CD28单抗1mg·L-1共同刺激。
两组培养液中均设CsA浓度梯度: 0、 0.1、 1、 10、 100、 1000μg·L-1。 另设CD
28单独刺激组、 未加任何刺激组和ConA刺激组作为对照。 置37℃培养箱(含5%CO2)培养72
小时, 培养终止前8小时加入1μCi［3H］标记胸腺嘧啶核苷。
四、 细胞增殖程度测定与评价: 以多头细胞收集仪收集细胞。 Beckman L5800液闪仪测
定同位素掺入后的cpm值。 在不同的CsA浓度及相应的细胞增殖程度之间作回归分析, 求出使
淋巴细胞增殖抑制达50%时的CsA浓度, 即ID50。 ID50增高, 表明对CsA敏感性降低。
结 果
一、 抗CD28单抗单独刺激组、 未加刺激组和ConA刺激组: 以抗CD28单抗单独刺激和未
加刺激组, PBMC无明显增殖反应, cpm值在100以内。 ConA刺激组增殖明显, 其cpm值较抗
CD3单抗+抗CD28单抗共同刺激组约高30%。
二、 抗CD3单抗单独刺激组: 淋巴细胞出现增殖反应。 不加CsA时cpm值为1 500~2 200。
CsA的抑制作用呈剂量依赖性, ID50为50~90μg·L-1。
三、 抗CD28单抗+抗CD3单抗共刺激组: 淋巴细胞增殖显著加强, 其cpm值较抗CD3单抗单
独刺激时约高5倍左右。 CsA的抑制作用也同样呈剂量依赖性, 但其ID50值比单独刺激时高
4~5倍。 见图1、 图2。
图1 两组cpm值变化
图2 两组细胞增殖受抑制的程度
讨 论
刺激CD3-T细胞受体(TCR)复合物能通过磷酯酰肌醇途径, 经过复杂的信号传导过程, 最终
导致T细胞核内基因的活化和转录, 产生细胞因子(IL-2)等, 以维持免疫细胞的克隆增殖, 此即
信号1, 为抗原特异性, 受主要组织相容性复合物(MHC)限制。 抗CD3单抗与CD3分子结合, 能产生
该活化信号1。 抗CD28单抗能模拟B7分子的作用, 与CD28分子结合, 产生共刺激信号2, 信号
2的产生无抗原特异性, 不受MHC限制。
B7: CD28/CTLA-4分子同属于Ig超基因族, 其基因具有高度同源性。 CD28是一种分子
量为44kD的糖蛋白, 在T细胞表面以单体或同源二聚体的形式表达, 膜外部分由二硫键构成I
g-V区样的折迭, 可以与配体相结合。 外周血中80%的T细胞表达CD28分子。 CTLA-4的结构
与CD28高度相似。 B7也是一种跨膜糖蛋白, 根据不同实验室克隆B7分子的差异, 将其分为B7-1(C
D80)、 B7-2(CD86)和B7-3［2］ 。
刺激CD28分子产生的共刺激信号2, 在T细胞活化增殖以及产生效应的过程中, 均起十分重
要的作用。 深入研究CsA等免疫抑制剂对该活化通路的影响, 有利于指导临床用药。
我们实验结果表明, 由抗CD3单抗单独刺激产生的信号1单独作用, 淋巴细胞并未充分活化
增殖, 且能被低浓度的CsA阻断; 若同时由抗CD28单抗提供共刺激信号2, 则可使淋巴细胞增
殖显著加强, 且对CsA不敏感, 产生明显抵抗, 其ID50比单独刺激时成倍增加。 抗CD28单抗
单独刺激无效, 不出现增殖反应。
CD28分子产生共刺激信号的机理尚未完全阐明, 但与CD3-TCR的信号产生和传导过程截
然不同。 有研究表明, 刺激CD28可以在基因转录前和转录后两个水平, 增加细胞因子的产生
: (1)T细胞通过TCR与抗原提呈细胞(APCs)交联后, 引起TCR和CD28寡聚体化, 由CD3-TCR
传导信号1后启动细胞因子基因; (2)在IL-2基因增强因子的-164~-154位置存在CD28反应
元件(CD28Response Elements, CD28RE)［3］, 刺激CD28可以增加IL-2增强子的活性,
使mRNA转录增加; (3)多种细胞因子mRNA的3′端非编码区存在的(AUUUA)3重复序列极易
被降解［4］, CD28能通过某种机制稳定mRNA, 增加细胞因子的产生。
抗CD28单抗和抗CD3单抗共刺激后淋巴细胞增殖明显增强, 是因为CD28共刺激能增加C
D3-TCR启动后各种细胞因子(尤其是IL-2)的产生, 并使T细胞由低细胞因子分泌量的自分泌转
到高细胞因子分泌量的旁分泌形式。
共刺激后淋巴细胞的增殖对CsA产生抵抗, ID50增高, 表明CsA不能阻断T细胞活化CD
28通路。 CsA能阻断CD3-TCR介导的Ca2+依赖的信号传导通路［1］。 CD28分子产生和传
导共刺激信号的过程中, 不依赖Ca2+浓度变化, 故能抵抗CsA的作用。 这是目前唯一已知的
对CsA不敏感的T细胞活化通路, 这一活化通路的存在不容忽视, 需采用其它方法加以阻断, 而
且阻断共刺激信号的产生, 可以诱导供者特异性免疫无反应状态［5］。 器官移植后细胞因子
表型由TH1向TH2转变［6］、 间接性抗原提呈、 CsA个体敏感性差异的产生、 以及慢性排斥反
应的发生［7］等过程, 都涉及这一活化通路。 体内的免疫反应高度复杂, CD3-TCR这一主要的
T细胞活化通路仍需由CsA加以阻断。
我们研究证实, CD28产生共刺激信号, 能显著增强淋巴细胞的增殖反应, 且对CsA产生抵
抗。 深入研究T细胞活化CD28通路, 对指导免疫抑制剂的合理应用及免疫耐受的诱导均有十
分重要的意义。
