摘 要 为了解慢性
HBV携带者体内
HBV病毒的状况，以选择
HBV前
S1／
S2为研究区段，应用半巢式
PCR法从
3例慢性
HBV携带者血清中扩增出
HBV前
S1／
S2基因，分别将其克隆于噬菌体
M13mp18、
M13mp19，每例随机筛选
10个阳性克隆，进行序列分析及遗传距离分析，结果发现：
3例病人各克隆分别与同源性最好的
HBV野生株相比，存在着明显的碱基替代、缺失和插入。此类病人体内的
HBV株同源性差，克隆间最大的遗传距离为
0.125。慢性
HBV携带者体内的
HBV株呈“相似株”分布。
关键词 HBV 前
S1／
S2 基因变异 相似株
中图号 R512.6
QUASISPECIES OF PreS GENE IN CHRONIC HBsAg CARRIERS
Zhang Rui，Gu Changhai，Xu Jing，Wang Haitao
（Infectious Diseases Center，Southwest Hospital，
Third Military Medical University，Chongqing 400038）
Abstract To investgate the HBV in chronic HBsAg carriers，the preS1／S2 were selected as studied regions. Half-nested polymerase chain reaction （PCR）was used to amplify HBV preS1／S2 gene from sera of 3 chronic HBsAg carriers．PCR products were cloned into M13mp18、M13mp19 vector for DNA sequencing．Results showed that compared with the wild-type HBV adr，all clones exhibited base insertion and substitution．The biggest genetic distance among those clones was 0．125．These data confirmed that quasispecies were the major characteristics in these chronic HBsAg carries．
Key words HBV，PreS1／S2，Gene mutation ，Quasispecies
乙型肝炎病毒（HBV）是已知的引起人类疾病的最小DNA病毒，它的致病性高度可变，从普通的亚临床感染到较少见的暴发性肝炎，而慢性感染者往往演变成慢性活动性肝炎、肝硬变和肝癌［1，2］。据估计，我国至少有1亿慢性HBV携带者，但造成这种长期携带的机制尚无定论。一般认为，HBV基因在感染者体内的变异和不断演化是其主要原因之一［2］。最近对HBV变异研究日益增多，国内也有一些报道［3］，但绝大多数研究采用PCR扩增产物直接序列分析或限制性片段长度多态性分析，这些分析方法均有其局限性，只有少数研究采用PCR产物克隆至测序载体进行分析，因此，对HBV变异程度的研究受到限制［4］。
为比较清晰地了解HBV基因的变异状况，我们采用半巢式PCR方法，从3例慢性HBV携带者血清中扩增出HBV前S1／S2基因，并用标准的分子生物学方法克隆至测序载体，每例随机选择10个克隆进行序列分析，发现慢性HBV携带者体内的HBV前S1／S2基因具有高度异质性，即所谓“相似株”（quasispecies）现象。
1 材料与方法
1.1 血清采集 3例慢性HBV携带者为广西地区普查人群，诊断均符合1995年全国《病毒性肝炎防治方案》，见表1。
表1 研究对象基本情况及HBV感染状况
Tab 1 Basic status and serum HBV mark in obsered objects
| Patient |
Sex |
Age |
Nationlity |
Serum marker |
Prognoisis
（among two years） |
| HBsAg |
HBeAg |
抗-HBc |
抗-HBe |
抗-HBs |
HBVDNA |
| F |
M |
41 |
Han |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
No change |
| H |
M |
38 |
Han |
＋ |
－ |
＋ |
－ |
－ |
＋ |
No change |
| Wu |
M |
57 |
Han |
＋ |
－ |
＋ |
＋ |
－ |
＋ |
No change |
1.2 菌种、质粒、噬菌体及其他试剂 大肠肝菌XL1-Blue为本室保存。噬菌体M13mp19、M13mp18购于华美生物工程公司。限制性内切酶PstI及KnpI购于Promega公司。T4DNA连接酶购于Promega公司。测序药盒（T7 Sequence Kit）购于USB公司，35S-α-dATP购于杜邦公司。Geneclean Ⅱ盒购于Bio101公司。QIAprep Spin M13盒为QIAGEN公司产品。
1.3 引物 前S／S基因PCR扩增所用引物为：
S1∶5-CGCGGTACCGGTCACCATATTCTTGGGAA-3（2815～2835），划线处为KpnI位点。
S2∶5-TGCGCTGCAGTTAGGGTTTAATGTATACC-3（842～832），划线处为PstI位点。
S3∶5-AAACTGCAGCCGTCCTGATGT（T／G）（G／A）TG（T／C）TCTCCAT-3（155～181），划线处为PstI位点。
1.4 血清中HBVDNA的扩增 取200μl血清，加20％PEG8000，冰浴40min，离心弃上清；加裂解液4mol／L异硫氰酸胍、25mmol／L柠檬酸钠等，冰浴沉淀，酚、氯仿抽提；用无水乙醇沉淀DNA后，将DNA溶解于20μl水中。先以引物S1、S2在94°C 1min、60°C 1.5min、72°C 1.5min条件下扩增30个循环，再取首轮扩增产物1μl以引物S1、S3在94°C 1min、64°C 1min、72°C 1min条件下扩增35个循环。扩增产物在1.5％琼脂糖电泳，在608bp处可见明显扩增带。
1.5 PCR产物的克隆和序列分析 根据文献提供的标准方法进行［5］。取M13mp19分别用PstI，KpnI酶切后，用Geneclean Ⅱ盒纯化（按试剂盒说明操作）。PCR扩增DNA产物也经同样双酶切，经酚、氯仿抽提后，用无水乙醇沉淀DNA，将DNA溶于水，在T4DNA连接酶参与下，连接目的基因和M13mp19，转化于XIL1-Blue菌，在含IPTG和X-gal的培养基上培养8h，随机挑取10个白色噬菌斑。在2×YT培养基中，于37°C培养5h，将M13mp19阳性克隆原种液以模板，用R、F引物扩增含阳性克隆的片段，再以上述方法分别进行PstI、KnpI酶切，并纯化与M13mp18载体连接后，以同样的方法制备M13mp18原种（方法同上）。以QIAGEN Spin M13盒按说明提取单链DNA。用T7测序药盒进行序列分析。放射自显影后读片。
1.6 序列的计算机分析 采用Goldkey软件（军事医学科学院吴加金等编制），对所有克隆进行同源性分析等。进化树分析采用PHYLIP（3.57版）软件包中的DNADIST和NEIGBOR1软件块。遗传距离算法采用JQININF方法。
2 结果
2.1 前S1／S2基因的变异方式 通过计算机分析，发现所测的30个克隆的核苷酸序列与基因库中已存入的国际上27个HBV全序中的HBVadr同源性最高，故以HBVadr为参照序列，与之相比，所有克隆中平均的替代率分别为4.06％，缺失率为1.2％，插入率0.23％，见表2。
表2 30个克隆与HBV野生株（adr）的前S1／S2核苷酸区序列比较的变异方式
Tab 2 Mutation models of the nucleotied sequences of preS1／S2 gene in 30 clones compared with HBVadr（wild type） |
Nucleotide
mutation |
Patients with chronic hepatitis B carry |
| F |
H |
Wu |
（x） |
Repalace
（％） |
22.7
（4.32） |
22
（4.19） |
19.6
（3.66） |
（4.06）
|
Deletion
（％） |
12.2
（2.3） |
3.6
（0.69） |
3.8
（0.71） |
（1.2）
|
Insertion
（％） |
0.9
（0.17） |
1.9
（0.36） |
0.9
（0.19） |
（0.23）
|
2.2 HBV前S区各克隆株间核苷酸与氨基酸的变异比较 通过计算机分析发现，每例病人的10个克隆间的核苷酸、氨基酸都发生了较大的变化，其中核苷酸的变异范围F为15～77碱基，H为3～105碱基，Wu为16～36碱基；氨基酸的变异范围F为14～99个，H为0～137个，Wu为21～160个。其中氨基酸的变异大于核苷酸的变异，具体见表3。
表3 克隆株与野生株之间核苷酸与氨基酸变异比较
Tab 3 Mutations of the nucleotide and amino acid sequences of preS1／S2 gene among clones and HBVadr （wild type） |
| Range（Rate） |
F |
H |
Wu |
| Nucleotide Mutation range |
15～77 |
3～105 |
16～36 |
| （Nucleotide Mutation rate）％ |
（2.86～4.679） |
（0.57～20.00） |
（3.054～6.86） |
| Nucleotide Mutation range |
14～99 |
0～137 |
21～160 |
| （Nucleotide Mutation rats）％ |
（8～56.69） |
（0～78.29） |
（12～91.43） |
2.3 慢性HBV携带者前S1／S2基因的遗传距离分析 对30条前S1／S2序列，用PHYLIP3.5c软件中心，DNADIS计算出每条序列之间的遗传距离（Jukes-Cantork距离系数）再用NEIGHBOR软件的NELGHBOR-JONIG方法按遗传距离绘制出遗传距离图。从图1～3图中，可以看出，每例病人的10个克隆遗传距离均不一样，病人H为0.018～0．12，克隆间的最大遗传距离为0．12；病人F0．0124～0．125，克隆间的最大遗传距离为0.125。病人Wu的10个克隆的遗传距离均不一样，（Wu5，Wu7，Wu8较接近），各克隆间的遗传距离为0．0125～0．0744，克隆间最大的遗传距离为0．0744。从图4中，可以看出，3个慢性HBV携带者病人体内的30个克隆的遗传距离不一致。但各病人有自己的遗传距离范围，说明慢性HBV携带者体内前S1／S2基因区呈高度的异质性，又有各自的遗传协同性，很可能是各从一支HBV野生株感染后在体内变异,进化成一群“相似株”，克隆间的遗传距离为0.0124～0.125。 |
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图 1 慢性乙型肝炎携带者H HBV前S1／S 210个克隆的遗传距离图
Fig 1 The Genetic distance among 10 clones of HBV Pre S1／S2
genes in the chronic hepatitis B carry patient H |
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图 2 慢性乙型肝炎携带者F HBV前S1／S2 10个克隆的遗传距离图
Fig 2 The Genetic distance among 10 clones of HBV Pre S1／S2
genes in the chronic hepatitis B carry patient F |
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图 3 慢性乙型肝炎携带者Wu HBV前S1／S2 10个克隆的遗传距离图
Fig 3 The Genetie distance among 10 clones of HBV Pre S1／S2
genes in the chronic hepatitis B carry patient Wu |
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图 4 慢性乙型肝炎携带者组HBV前S1／S2 30个克隆的遗传距离图
Fig 4 Fig 4 The Genetic distance among 30 colnes of HBV Pre S1／S2
genes in the chronic hepatitis B carriers groups
3 讨论
基因的高度异质性，或多个病毒变种组成的某个病毒群，通常称为“相似株”（quasispecies）。“相似株”一词源于1971年Eigen等描述地球早期生命演化时，给一系列相关但不同的核酸克隆下的定义［6］。以后，人们在分析噬菌体Qβ群中的单个病毒克隆的RNA时发现，“相似株”确实存在。最近，这一概念已广泛用于HIV、HCV在人群中的分布研究，并用此概念来解释像HIV和HCV这类病毒为何能逃脱宿主免疫机制、长期在宿主体内生存的问题［7，8］。虽然在慢性HBV感染中已发现多个HBV变异株，但“相似株”的概念仍少见于HBV的研究。
本研究采用标准的单个克隆的序列分析方法，避免了常用的PCR产物直接测序容易测出PCR产物混合物中的优势株，而错过混合物中其他序列的缺点。从本结果可以看出，如果用PCR产物直接测序，每例患者只能测出一条、而不能测出10条不同的序列。实际上，尤其是像检测存在“相似株”这样的样品，PCR直接测序极有可能得到带偏向性的结果。因此，作者建议，有条件时，应尽量在克隆PCR产物后，测定多个克隆的序列。本研究结果还显示，3例慢性HBV携带者体内的HBV前S1／S2基因为典型的“相似株”，可以推断，若加大序列分析数目，如20个、100个，有可能得到更为清晰的结果。
一般认为，“相似株”现象是由于病毒基因复制过程中突变和宿主免疫压力交互作用的结果［9］。但为何大部分HBV感染者都能清除病毒，只有少部分人成为慢性HBV携带者？有人认为：慢性携带状态与HBV初次感染年龄有关。有资料表明，出生时感染HBV，90％感染者有可能演变成慢性携带者，而只有10％的成年感染者会成为慢性携带者［10］。作者认为，除此以外，还应考虑初次HBV感染时病毒的状况，即病毒是呈“相似株”，还是病毒基因比较单一。因为机体消除单一基因型的病毒一般比清除“相似株”病毒容易。
本研究报道的3例慢性HBV携带者体内的10个克隆间的同源性差，每例病人的10个克隆几乎均不一样，呈“相似株”分布，与野生株相比所有克隆的碱基替代率、缺失率、插入率均偏高，为4.06％，1.2％，0.22％，而且变异似乎没有固定的模式，为“杂乱”、“小规模”的突变，所有病人体内HBV前S1／S2区各克隆间的遗传距离也不一致。相对距离最远，克隆间的最大遗传距离为0.125。推测①慢性HBV携带者初始感染HBV可能为一株HBV毒株，由于机体的体液和细胞免疫功能的欠缺导致机体不能清除HBV，使之得以生存，并随着病毒的衍化，分化出数支以上的“相似株”。②慢性HBV携带者初始感染时就感染一群HBV“相似株”而使机体的免疫反应难以清除，得以在体内生存衍化。
本研究报道的慢性HBV携带者体内前S1／S2基因的高度变异质性表明，HBV变异比人们以往认识的要严重得多。最近有人报道，HBV突变率为2×10－4／（碱基.年）［11］，为一般DNA病毒的104倍，但比RNA病毒低。可以设想，要清除体内有如此大变异的病毒群，对人体免疫系统是何等大的负荷。如本文报道的，3个病人中10个克隆中氨基酸的变异分别为8～56．59％，0～78．29％，12～91．43％，可以推测诱导体液免疫和细胞免疫的抗原表位变异也必然很大。体内原先能识别抗原位点的中和抗体和特异性细胞毒性T细胞（CTL）也不能再识别不断变异的抗原位点，导致已建立起来的免疫无效或低效。近来有资料表明［12，13］：即使同一抗原表位侧翼的氨基酸发生改变，也能造成原先的中和抗体和CTL不能再识别，导致免疫无能。这可能是像HBV这种变异较大的病毒得以在宿主体内长期生存的原因之一。尽管HBV变异研究日益增多，但变异与临床关系仍令人不解。
* 本课题受国家自然科学基金资助（39270642）
作者简介 第一作者：女，35岁，博士，主治医师
作者单位：张 瑞、顾长海(第三军医大学西南医院全军传染病专科中心 重庆 400038)
徐 静、王海涛(军事医学科学院) |
