图1　COM、ECM和CC对中国仓鼠精子顶体反应的影响
COM.卵丘细胞及其细胞外基质.ECM.细胞外基质 CC.卵丘细胞
Fig.1 Effect of COM,CC and ECM on the AR in CHA spermatozoa.
COM：cumulus oophorus and matrix
ECM:extracellular matrix
CC:cumullus cells

4.精子顶体状态的评价方法
　　在相差显微镜下，CHA精子顶体帽可分为两种类型：(1)顶体帽完整而紧密，外形光滑，顶体吻端有明显的钩；(2)AR精子，顶体帽缺如。体内、外AF、COM和ZP上精子顶体状态的评价：收集壶腹AF和卵子及其COM，在相差显微镜下观察上述诸部位的精子顶体帽状况。具体操作见文献报道方法^［6］。
5.COM中P₄的测定
　　收集40只CHA超排卵后的COM约0.5ml，经37℃1h孵育后离心(14 000×g,15min)，除去CM后得到ECM0.3ml，取0.2ml测定P₄；另0.1ml测GAG。同时取0.3ml混合血浆，然后根据WHO人类生殖规划处提供的RIA配对试剂，按WHO RIA测定手册(1985，第9版)操作，采用内标准法测量，回收率达90%。高、中、低浓度质量控制的批内变异系数分别为12.3%、8.8%和6.6%。批间变异系数分别为6.6%、8.0%和9.1%，均符合测定技术要求。
6.GAG的测定
　　按刘秉慈报道的阿利新蓝法测定GAG总量，将阿利新蓝8 GX按1.4g/L(w/v)溶解于0.5mol/L乙酸钠溶液中，临用前配制。然后于试管中加入0.1 mlCOM或GAG，空白对照管中加0.1ml去离子水。准确加入1.5ml阿利新蓝，在vortex上充分混匀。10min后，在721光电比色计上用1.0ml比色杯(波长480nm)进行比色测定。然后经常规醋酸纤维膜电泳法分离GAG中的相对含量^［7］。
7.CC与ECM的分离
　　为了探讨诱发AR因子是在卵CC中还是ECM中，将COM置于0.2μm(φ)微孔滤膜(国家海洋局第二海洋研究所，杭州)制成的袋里，悬挂于含CHA精子悬液的试管中(图1)，于37℃, 5%CO₂, 95%空气中培养7h或COM经37℃孵育后离心(14 000g,15min)，将CC与ECM分离。CC经mTS离心洗涤3次，然后将CC和ECM分别置于微孔滤膜袋中，按上法培养7h。最后分别评价COM、CC和ECM对精子AR的作用。
8.体外诱发精子AR
　　当精子在无COM存在下，加入各种因子，如GAG、透明质酸(HA)、肝素(HE)和孕酮(P₄)等诱发精子AR，获能培养5h，以评价精子对上述因子的反应能力。
9.精子穿卵试验(sperm penetration assay,SPA)
　　为了鉴定COM诱发的AR精子的受精能力，采用精子穿透去透明带仓鼠卵试验来评价CHA精子的受精能力。SPA方法按本实验室报道方法^［8］。
　　所有结果采用均值±标准差(±s)表示，组间差异的显著性测定，采用t检验，以P＜0.05为显著性差异。

结　　果

1.体内与体外诱发精子AR(部位)的比较
　　体内精子AR率随精子通过AF(58.2%)和COM时逐渐增加(93.0%)；当精子抵达ZP时(94.0%)已完成AR。在体外试验中，精子在COM和ZP及单独ZP中，AR率为76.5±7.0%和16.4±4.2%，显著低于体内AR率(P＜0.01)，但又明显高于空白对照组(3.5±1.5%，P＜0.01)。
2.COM、COM-free和GHCOM对CHA精子获能的作用
　　CHA精子在COM中AR率随培养时间的延长而增加，呈时间依赖关系。CHA精子获能培养3h时，AR可达到34.5±5.3%，表明该部分精子已经获能。而COM-free对AR无作用。GHCOM对CHA精子AR也有激发作用，虽明显低于其自身COM的作用(P＜0.01)，但仍显著高于COM-free组(P＜0.01)。在5h CHA精子AR率约为50%(图2)。
3.ECM中的主要成分

图2　COM和GHCOM对CHA精子获能的影响：COM.中国仓鼠卵丘细胞及胞外基质 GHCOM.金黄仓鼠卵丘细胞及胞外基质 motility.精子活率 COM-free.不含中国仓鼠卵丘细胞及胞外基质　a与相对应b比较，P＜0.01
Fig.2 Effect of COM and GHCOM on capacitation in CHA spermatozoa. COM represents the COM of CHA;GHCOM means the COM of golden hamster.a:P＜0.01 as compared to the relevant b.

图3　糖胺多糖(GAG)诱发CHA获能精子顶体反应。a:与相应对照组各点比较P＜0.001
Fig.3 GAG induced the AR of capacitated spermatozoa in CHA. a:P＜0.001 when compared to the control.

图4　孕酮激发获能CHA精子AR及其穿卵能力(SPA)
motility. 精子活率，SPA.精子穿卵试验 AR.顶体反应
Fig.4 Progesterone initiates capacitated spermatozoa AR and SPA in CHA. SPA：Sperm penetration assay;AR：Acrosome reaction

　　为了阐明COM中诱发因子是在哪一组分，在透析试验中，单独CC几乎不能激发CHA精子发生AR，而ECM是诱发CHA精子AR的主要组分(表1)。那么，在ECM中存在何种成分?经RIA测定ECM中含有P₄，其浓度为1.3mg/L ECM，而血浆为12.5μg/L。两者浓度之差为100多倍。此外，ECM中经醋酸纤维素薄膜电泳与参比样品GAG同时点样操作，证明ECM中富含GAG，其总量约为5mg/L，其中主要为HA，其次为HE以及其他一些未知样品。但本方法只能对HA和HE定性而不能定量。
4.GAG和P₄对CHA获能精子AR的作用
　　GAG和P₄均可引起CHA获能精子发生AR。AR率随GAG和P₄剂量而增加，并存在着明显的量效关系(图3，4)。但两者对AR无协同作用(结果未列出)。P₄不仅可促进AR，而且还可明显地提高CHA精子穿透去透明带仓鼠卵的能力(SPA，图4)。其最大促进作用的浓度为25μg/L。
5.各种因子对获能CHA精子AR的作用(表2)
　　输卵管液(AF)和孵泡液(FF)具有明显地诱发CHA获能精子发生AR。HA、HE、dbcAMP和forskolin也有此作用，但明显弱于前两者。HA和HE两者无协同或加强作用(结果未列出)。

表1　COM、ECM、ZP和CC对CHA
精子顶体反应的影响
Table 1 Effects of COM,ECM,ZP and
CC on the acrosome reaction in Chinese hamster spermatozoa

表2　影响CHA精子顶体反应的其他因子
Table 2 Factor(s) affecting Chinese hamster
sperm acrosome reaction in vitro

讨　　论

　　在自然情况下，精子获能是在雌性生殖道内进行的。然而，精子究竟在何处获能，至今尚未完全阐明。一般认为精子获能始于宫颈，通过宫腔和输卵管的转运，逐渐获得了受精能力，最后完成于输卵管壶腹部。当获能精子进入或穿过COM并与ZP结合时，精子被激活，呈现一种特殊的运动即超激活运动(hyperactivated motility)，其头部发生AR或称胞吐作用(exocytosis)。获能是精子AR的前提，AR标志着获能的完成。因此，可通过超激活运动和AR来评价群体精子获能状况。本实验从AF中收集精子383，其中223精子已发生AR(58.2%)；同样，AF在体外也可引起CHA精子AR(48.5±5.7%，表2)。这与一些学者报道AF是豚鼠、兔、绵羊和仓鼠体内精子AR部位之一的结果相符^［6，9］。AF存在着何种获能诱发因子，目前还不完全清楚。也可能存在着肝素样物质GAG，它能引起牛精子获能^［9］。
　　CHA精子无论在体内或体外，均可在COM和ZP复合物中发生AR，而且体内AR率明显高于体外(P＜0.01)。本研究虽然未观察体内人工授精后不同时间收集的COM中的精子AR状况， 但在体外COM获能培养系统中，3 h CHA精子AR率可达到34.5±5.3%，而且随培养时间的延长，AR率呈明显增加趋势(图2)，表明CHA精子获能与时间呈依赖关系。可见COM是CHA精子获能和AR的主要部位。GHCOM对CHA精子AR也具有一定的刺激作用，其作用发生于预培养5h；与CHACOM比较，获能时间明显滞后。由此推测，CHA精子获能时间至少3～5h。为何GHCOM对CHA精子获能也有作用?近几年来发现，COM可捕获和分泌P₄^［10］本实验结果也证明COM中存在较高的P₄。近几年证明，P₄对人及其他哺乳动物获能精子也具有促进AR作用，且无种属差异性。据Blackmore等^［11］报道，P₄可刺激胞外Ca²⁺内流，使胞内Ca²⁺浓度上升，从而激发精子AR。这种作用是通过位于精子表面GABA_A样受体或GABA_A/Cl^-受体和Ca²⁺通道发挥作用^{［12，13］}。这些结果表明，凡是获能的精子均可对P₄的刺激引起AR。据此，P₄可作为一种探针来鉴别精子是否获能。
　　如前所述，获能的终点是发生AR，AR依赖于获能。AR又是受精的前提，只有发生AR的精子才能穿过ZP并与卵膜融合^［1］。由此可见，AR是受精的关键步骤之一。WHO1992年已将精子AR能力作为评价精子受精功能的重要指标之一。然而，精子虽然获能，如无天然或人工激动剂存在，精子仍不能发生真正的AR。自发性AR虽可发生，但这种精子并无受精能力^［1］。CHA精子在COM中可发生AR，7h AR率可达到76.5±7.0%，据此可推测，COM中必然存在着AR天然诱发因子。目前，一般认为ZP(主要是ZP₃)和P₄是体内AR的天然诱发因子^［1，14］，而且发生AR的精子具有受精能力。但令人费解的是，单独的CHA卵ZP触发AR率明显低于COM组(表1)，也不能提高受精率^［5］。这一结果与多数哺乳动物卵ZP是获能精子AR的诱发者相悖。这是否与我们未使用可溶性ZP糖蛋白有关，还是CHA是一种特殊种类，尚需积累更多的资料，才能下结论。
　　COM可引起CHA精子获能，促进AR，从而提高受精能力，该因子存在于CC还是ECM中?本研究结果表明，这种激发因子是在ECM中而非CC本身(表1)。ECM广泛存在于机体各部位的组织中，以维持细胞的生存、分化和运动。但它们的成分不尽相同。近几年来，卵丘细胞及其细胞外基质在受精生物学中的作用日益引起人们的重视。据报道，COM除了捕获及分泌P₄^［10］和前列腺素外，其主要成分为GAG，包括HA、HE、几丁质、角蛋白和软骨素等。另外，其中HE可参与牛精子获能^［9］，促进多种动物精子AR^［13］。本研究结果证明，COM中存在P₄、HA和HE，它们均可明显地促进CHA精子获能和获能精子发生AR(表2)。而且P₄还可明显地提高CHA精子的受精能力(图4)。近年来，一些研究业已证明精子表面存在着上述相应配体的受体^{［1，4，11，13］}。COM携带诱发AR的多种配体，通过配体-特异性受体-G蛋白介导-效应酶-胞内第二信使-效应器的信息传递方式，触发精子发生AR。这似与P₄可促进人精子AR，从而提高受精率相一致。
　　赵秀菊副研究员协助孕酮放免测定，特此致谢。