伤口愈合是机体对组织损伤后的一种反应，它涉及各种细胞、细胞外基质、可溶性介质和细胞分子间的相互作用【1】，是一种阶梯式的由分子信号高度调控的，以恢复正常组织的功能及形态完整为目的的复杂的细胞活动。
实验研究显示，局部应用生长因子可促进伤口愈合【2】，但临床效果却不尽人意。原因主要有：(1)穿透力弱；(2)生物半衰期短；(3)吸附细胞外基质成分，生物利用率差；(4)机体蛋白酶活性上调使其降解加速；(5)需反复应用且剂量要大；(6)费用昂贵等。这些因素在很大程度上限制了生长因子的临床应用。因此，寻求新的、更有效的治疗途径就更加迫切。分子生物学技术的发展和进步，特别是基因治疗在临床上取得的初步成功，为解决这一难题提供了前所未有的希望。
基因治疗的基本概念是诱导治疗性基因进入靶细胞，基因的表达可导致治疗疾病或对组织生长和再生提供暂时的益处。为了达到这一目的，首先必须把治疗性基因转送至特异性靶细胞；其次，基因的表达需达到一定的水平且持续一定的时间；再者，靶细胞中基因表达的水平和时相应能被某种因素所控制【3】。伤口愈合的基因治疗，是指将对组织愈合有益的一些生长因子基因导人参与修复的细胞中，使其高效表达一定的时间，在局部释放适量的特异性治疗性蛋白质，从而达到克服以往治疗的缺陷，促进伤口愈合，并提高愈合质量的目的【4】。
组织修复与基因转移
一、基因转移方案
1．回体转移途径：在培养条件下将基因直接导入来源于患者的靶细胞，然后再将这些细胞移植回供体。这种基因治疗方案可对经遗传修饰的靶细胞进行更好的控制，但仅限于那些培养和移植技术趋于成熟的细胞。
2．活体直接转移途径：避免了细胞培养和移植的需要，在活体上将基因导人靶细胞，直接且方便，但准确性稍差。
二、基因转移的方法
1．病毒载体系统：病毒是基因转移的自然载体和第一选择。重组的病毒是将其自身复制的序列除去，而替代以外源性成的DNA序列。对进入细胞和转送基因所必需的病毒蛋白由包装的细胞系提供。特殊的优缺点决定着每个病毒系统的取舍，即外源性基因的大小、靶细胞的特性、基因表达时相、免疫原性大小和与宿主基因组结合的能力等。
逆转录病毒载体系统：逆转录病毒被单纯RNA病毒所包裹，进入宿主细胞时，RNA被逆转录为双链DNA分子，然后整合至宿主细胞的染色体上。这样，它提供一个稳定的转录和治疗性基因的长时相的表达。但它有两个缺陷：一是仅感染单独的细胞；二是整合至染色体上是以随机的方式进行的，有诱导细胞转化的可能性，虽然这种机率很低。Morgan等【5】首次报道采用此方法于皮肤的基因治疗，他发现将人生长激素转染于体外培养的角朊细胞后，再回植于供体，此细胞可分泌有生物活性的人生长激素，且可形成复层性表皮。Eming等【6】将血小板衍生生长因子A(PDGF-A)导入角朊细胞，然后在无细胞异体真皮上培养，再进行移植，可显著地提高复合皮的质量。用携带血管内皮细胞生长因子(VEGF)的逆转录病毒对成纤维细胞进行基因修饰，使其过度表达VEGF，将此细胞用于皮肤替代物中，发现真皮中血管数量增加，再血管化时间缩短【7】。
腺病毒载体系统：人腺病毒有一36kb的双链DNA基因，在正常的病毒生活周期中的表达受到高度控制。腺病毒通过受体介导的吞噬现象进入细胞内并转送至细胞核。重组的腺病毒用于基因治疗时，其El和E3区被去除，使其无法复制。与其他基因转移方法相比，腺病毒载体有其优越性：(1)可感染全部的人体细胞，且效率高达95％以上，并不需要细胞处于分裂状态；(2)不诱导感染的细胞发生表型的改变；(3)转移后，仍以附加体形式存在，一般不整合到宿主基因组中。基因表达时相较短是其用于其他类型的基因治疗时的主要缺陷，然而在伤口愈合中，这些缺陷反而有利【8】。因为伤口愈合进程本身就是个有限的过程，表达时相有限可避免基因长时间表达所引起的副反应。Liechty等【9】用含全长人PDGF-B cDNA的重组腺病毒(Ad—PDGF-B)进行基因转移，来检测这样是否可诱导涉及伤口愈合反应的细胞过度表达PDGF-B，从而达到纠正缺血性伤口愈合不良的目的。他在兔耳缺血性伤口模型上一次性应用Ad-PDGF-B，发现伤口肉芽组织和细胞外基质的形成和血管生成显著性增加，缺血性伤口的愈合速度反而较不缺血性伤口还快。在糖尿病性小鼠切割伤愈合过程中也观察到类似的现象，表明PDGF-B用于基因治疗时，可完全纠正难愈性伤口愈合不良的缺陷。NO合成酶在伤口愈合中的重要作用已被NO合成酶基因剔除小鼠的伤口愈合不良所证明，而这种难愈性伤口可因一次性应用含NO合成酶cDNA的腺病毒所完全纠正【lO】。
2．非病毒载体系统：裸DNA基因转移，去除了传染性因素，使其毒性减少至最低限度。现已发现质粒DNA可转移至各种组织中并能表达。皮下注射后，基因表达水平足够激发临床反应【11】。
(1)粒子介导的基因转移，即基因枪技术：是利用物理力量穿透靶细胞膜，从而输送粘附在大小约1～5μm的微小金颗粒上的DNA。动物研究发现在表皮和真皮中，用此方法均有高水平的局部转基因表达【12】。大多数实验发现，当颗粒打击到角朊细胞基层时可达最佳表达【13】。若轰击得更深时，表达效率则降低，因为在细胞外基质中细胞变得较为弥散。基因表达高峰是轰击后1～3 d，1周后表达水平显著下降。该技术的优点是可用于不同类型的细胞和组织；可转移较大的DNA分子；轰击粒子的大负载量可允许多种基因同时进人靶细胞，这有助于评价在一种组织中多个基因的协同表达效果。Eming等【14】用此技术将PDGF导入伤口中，2周后，伤口抗撕裂强度增加了75％～100％，较局部外用相应的重组生长因子效果好。近年来，研究集中在用编码VEGF的基因转染缺血性细胞，使其产生VEGF，使血管生成增加，改善缺血状态，用来纠正心肌缺血和皮瓣缺血。目前动物实验已经成功，临床验证也正在进行中【15】。对肢体缺血性患者，将2000 μg编码vEGFl65的裸DNA送入血管中，治疗4个月后，血管生成明显增多，随访12周治疗效果仍然存在。
(2)阳离子脂质体技术：阳离子脂质体是一合成载体，通过电离的相互作用有效地形成一带负电的DNA分子复合体，此复合体与靶细胞膜相互作用，使DNA分子通过吞噬作用进入细胞中。优点是可转送大分子量的DNA，抗原性低，操作容易，成本低；缺点是体内感染效率较低。Taub等【16】用此技术转移VEGF基因于大鼠缺血性皮瓣模型中取得初步疗效。发现皮瓣远端有vEGF基因的表达，94％皮瓣区域最后存活，而对照组皮瓣存活率仅28％-32％。胰岛素样生长因子(IGF-1)用于烧伤患者可提高代谢，促进肌蛋白合成，增强机体的免疫功能，从多方面促进烧伤患者的伤口愈合进程。但其明显的副反应如低血糖、电介质失衡、精神状态异常、水肿、头痛等限制了其临床应用。副反应产生的原因是机体中超生理剂量的游离IGF-1，因为只有这样的剂量才能发挥其治疗性生物效应。因此，如何能最大限度地发挥其生物效应，从而达到治疗效果而同时又避免其副反应的发生就显得很有意义。
Jeschke等【17】用大鼠60％Ⅲ度烫伤模型，每周皮下注射1次由阳离子脂质体携带的编码胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因的cDNA，发现皮肤组织中IGF-1蛋白浓度显著增高，组织增生和再上皮化速度明显加快。整个治疗过程中，未发现任何明显的副反应发生。进一步研究证实，IGF-1蛋白的表达增加始终局限于注射区的周围【17】，且多点注射较单一注射效果更好。而血液及其他重要脏器组织中未见IGF-1蛋白明显升高，故而避免了副反应的发生。这也充分显示了基因治疗在伤口愈合领域的独特优越性。
(3)微粒种植技术：通过一套坚硬的振荡性微注射器，把目的基因送入靶细胞中。基因表达的量可由DNA强度和注入量来控制。它与单一注射法和基因枪技术均不同。它是通过一套坚硬的微针而不是单一的针管运送基因，而基因枪是利用大量随机的细胞孔隙。此外，它不会造成任何异物(如金颗粒)在靶细胞中沉积，质粒液体的准备也很省力，转送的效率也较高。现已成功地用于伤口愈合的治疗中【18】。
(4)寡核苷酸技术：现代分子生物学技术已能合成与靶基因序列相互补的寡核苷酸，称之为反义寡核苷酸(ODN)。因此它可用来阻断特异性基因的转录或翻译，从而达到临床治疗的目的。这种反义技术作为研究生物过程的调控机制和潜在性治疗手段，已显得越来越重要。反义技术已用于治疗韧带瘢痕，将兔decorin反义寡核苷酸送人韧带瘢痕中，导致decorin mRNA和蛋白表达下降，促使瘢痕软化【19】。将工型前胶原基因反义核酸通过微注射法作用于裸鼠瘢痕，发现能有效地抑制增生性瘢痕中I型胶原蛋白的合成，从而抑制瘢痕增生【20】。同样，正义寡核苷酸技术也已用于伤口愈合领域中。众所周知，转化生长因子β(TGFβ)是由人体多种细胞合成的一种多效应性生长因子，与组织纤维化和瘢痕形成有密切关系。用含调控TGFβ成分的单链正义寡核苷酸作为“诱饵”结合TGFβ激活蛋白，来竞争TGFβ中的α1(I)前胶原蛋白基因，从而抑制其转录，特异性地抑制胶原的合成，有抗纤维化效果且无明显的毒副反应【21】。
(5)基因芯片(DNA芯片、生物芯片)：随着生物技术的迅猛发展，常规的杂交技术已无法满足大规模、高通量的杂交要求。而提高总样密度和探测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅片等材料为载体的基因芯片技术已经问世。该技术系指将大量(通常每平方厘米点阵密度高于400)探针分子固定于支持物(如硅片)上后，与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息，它使得合成、固定高密度的数以百计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微数扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。采用微矩阵基因芯片技术【22】，寻找和筛选烧伤后增生性瘢痕发生，发展中的特异性基因，发现在4096种基因中，增生性瘢痕与正常皮肤间存在着差异表达基因。
基因转移技术在临床上的应用
虽然人类对基因治疗的研究已进行了多年，不少方面也取得了可喜的进展，但绝大多数尚局限于基础研究和动物模型阶段，能真正用于临床治疗的较少。其主要原因是基因转移效率低、不稳定和基因转移后无法进行人为调控。Embil等【23】将基因重组性血小板衍生生长因子-BB用于临床治疗134例糖尿病性溃疡，取得较好的疗效，同时证明安全性也很高。Sylvester等【24】研究了腺病毒介导的基因转移技术对正常的伤口愈合过程的影响，发现仅仅是急性炎症反应有轻度增加，愈合速度加快，无其他毒副反应。Margolis等【25】对已获FDA批准用于治疗糖尿病溃疡的重组人PDGF进行了1期临床验证，重点是有效性、安全性和毒性方面的探测。证明重组的PDGF对这种难愈性创面的治疗是有效的、安全的，但其临床疗效要逊于动物模型。造成这种差别的原因可能来自两个方面：(1)种属间的差异性；(2)动物模型的可靠性不够，即目前的各种难愈性伤口动物模型尚不能100％地模仿人类伤口的各种特性，不能从真正意义上反映人类伤口的各种复杂的病理变化。而且，基因治疗在安全性方面还需要时间的检验和大规模、多中心的临床验证。
展 望
随着基因技术的持续发展，基因治疗将在急、慢性伤口的治疗中占更重要的地位。预计不久的将来，可能会在以下几个方面有所突破：(1)有效的基因表达监测分析方法，现已初显端倪，称eDNA微矩阵【26】，(2)基因的多次转移；(3)多种生长因子的综合基因治疗；(4)可溶性生长因子受体的基因转移，从而达到从伤口微环境中功能性剔除某特异性生长因子的目的；(5)功能更优越的转移载体的发现。近来，一种“辅助依赖性腺病毒载体”已经问世，其免疫原性更低，转移后基因表达更加稳定【27】；(6)使基因开关的开和关调节生长因子基因的表达成为可能；(7)人为地调控各种生长因子在伤口中的表达水平和时相，最大限度地发挥其生物作用并降低其由于过度表达而产生的副反应，使人类能在真正意义上控制伤口愈合进程。而且，随着医学的发展和科学技术的进步，基因治疗的有效性和安全性会大大提高，毒副反应会进一步减轻。相信不久的将来，基因治疗能真正用于临床，服务于全人类。
