上海复旦大学附属华山医院 施光峰

　　近年来，肝脏病学在诊断技术上，特别是利用分子生物学技术进行诊断，有了新的进展。

　　（一）新的核酸检测技术在乙肝中的应用

　　1．血清HBV-DNA实时定量检测

　　目前血清HBV-DNA定量检测方法的敏感范围是在103~106拷贝数/ml，而实时PCR技术可以将HBV-DNA检测的敏感范围增加为50~109拷贝数/ml。因此，实时PCR技术在诊断隐匿性乙肝方面有特别重要的意义，在检测血液捐赠者中是否有慢性肝病的病因学诊断方面就有重要的应用价值。

　　2．肝内cccDNA检测

　　过去研究HBV cccDNA的障碍是，一要通过肝活检获得肝组织；二是缺乏敏感、特异、定量的方法从活检组织中检测出cccDNA。

　　近年有个特殊的新方法是通过两个主要步骤来检测cccDNA。一步是通过质粒安全的脱氧核糖核酸酶降解非共价闭合环状DNA；另一步是用引物定位在松弛环状DNA的断端，进行扩增cccDNA，用实时PCR的方法通过标记探针定量检测病毒DNA。此结果需通过定量检测一定数目细胞的β球蛋白的基因来标化校正。

　　3．HBV基因型和基因序列检测

　　基因序列分析依然是分析病毒基因的金标准。其主要优点是可以检测出新的变异株，这对用了抗病毒药物治疗的病人检测出未知的耐药突变株特别重要；缺点是耗时，所有相关的区域都需要PCR扩增和基因序列分析。目前正在研究更简单可以分析HBV基因序列的方法。

　　4．线性探针检测技术

　　线性探针技术可以检测病毒的基因型、前C区、BCP变异和多聚酶基因变异。它的优点是即使病毒变异少到只有5%，它也可以检测出来，特异性、可重复性和敏感性均较好。因此，如果患者的血清中病毒载量开始升高，可以用这一方法早期诊断病毒耐药。其缺点是只能检测已知的变异，如果要检测新的耐药变异株，需设计新的探针。

　　5．DNA芯片技术

　　DNA芯片技术是一个更加强有力的分析HBV基因技术。HBV芯片技术是复式扩增整个HBV基因，一个高密度的HBV芯片可以检测多达200个变异株的151个位点及病毒的基因型。其优点是可以一次分析整个HBV基因序列；缺点和线性探针方法类似，只能分析已知的病毒株，对新的病毒株需设计新的相应的芯片。

　　6．表型分析

　　目前表型分析的方法有非载体和载体介导两种方法。非载体表型分析是PCR扩增整个HBV基因，然后将扩增产物转染入体外肝细胞，做药敏试验。载体介导的方法是HBV多聚酶基因或整个HBV基因克隆至质粒载体，然后转染入细胞，做药敏试验。这些方法可以用来研究病毒对药物耐药和交叉耐药的情况。

　　（二）新的核酸检测技术在丙肝中的应用

　　病毒的基因型可以通过直接检测5’非编码区序列分析，或是用特定的基因型探针定位在5’非编码区，通过反向杂交分析的方法检测。而病毒载量可以通过PCR定量检测。实时PCR可以检测5~30iu/ml的HCV-RNA，而且比经典的扩增技术更快速，更敏感，且没有污染。

　　现在丙肝治疗的终点和有效性是出现持续病毒学应答（SVR），即抗病毒治疗结束24周后，血清HCV RNA低于50iu/ml。在不同的治疗时间点定量检测HCV RNA十分重要，该检测结果既可以预测是否会出现持续病毒学应答，也可以确定治疗终点。另外，现在研究的一些新的治疗丙肝的药物，如丙肝病毒蛋白酶抑制剂，也需要核酸检测技术快速检测技术来确定耐药的变异株。

　　（三）肝活检技术

　　肝活检对肝功能异常的病因诊断，了解肝脏的炎症和纤维化程度及评价治疗的效果和预后十分重要。

　　1．经皮肝活检

　　其并发症的发生率与操作者的熟练程度有关，操作数少于20个的并发症发生率为3.2%，操作数超过100个的并发症发生率为1.1%。肝活检的死亡率在0.1%~0.01%。针切活检易发生出血、气胸、胆漏和腹膜炎的并发症，而针吸活检易发生误穿其它脏器和败血症的并发症。针切活检的并发症发生率为0.35%，针吸活检的并发症发生率为0.1%。

　　2．超声引导下肝活检

　　超声引导下肝活检是超声仪器上有一个引导针的狭槽，针的直径小于1mm，在超声引导下避开血管，至肝表面后采用针吸或针切的方法活检。并发症发生率低，死亡率约为0.006%~0.1%。

　　3．经颈静脉肝活检

　　经颈静脉肝活检技术适用于由于肝病或全身疾病存在严重凝血功能障碍的患者。该肝活检的方法是通过穿刺经右侧颈内静脉留置导管进入肝静脉，让患者停止呼吸，快速进入1~2cm，吸取肝组织，完成活检。此项技术理论上有心律失常和需使用X线及材料相关的不良反应，但是个安全的方法。操作较耗时，需要45分钟左右，而且导管和针的成本较高。所以这是一个二线选择，仅限于有严重凝血功能障碍的病人。

　　4．腹腔镜下肝活检

　　腹腔镜下肝活检本质上不是一个活检技术，但是它也是一种直视下获取肝组织的方法。现在可以使用迷你腹腔镜进行操作，这样出血风险更小，甚至可以在INR＞1.5，血小板＜50nl的病人中进行操作。腹腔镜下活检时采用针吸或针切两种方法均可，也可以至特定的病变部位的肝表面活检。合并腹水的病人不是操作的禁忌，可以在活检前，经腹腔镜抽腹水。腹腔镜总的并发症发生率约为2.5%，可以在直视下止血，所以出血率极低，仅0.09%，死亡率约为0.03%。该技术优点是，如果患者病变局限，可以很好的定位，提高病理的阳性率，如果是肿瘤患者，可以发现有无腹膜转移等，从而可以制定治疗方案。

　　（四）评价肝纤维化的非侵袭性试验

　　肝活检是诊断肝纤维化的金标准。如果不能进行肝活检，可以依据血清标记物来判断肝纤维化情况。血清标志物分为间接标记物和直接标记物。间接标记物多为肝功能的改变，如转氨酶，胆红素，血小板计数和凝血功能。直接标志物来源于肝细胞质，如透明质酸，胶原蛋白IV，Ⅲ型前胶原蛋白，IV前胶原蛋白C肽，IV前胶原蛋白N肽，细胞质金属蛋白酶，金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1），细胞因子（转化生长因子β，肿瘤坏死因子α,脂肪素），基因分析（DDD minor allele或DDX5-POLG2，CPT1A）等。现在常采用多个指标联合评价肝纤维化情况，如Fibrospect II就使用HA，TIMP-1，α-2巨球蛋白三个指标，结果鉴别有无中度重度肝纤维化的准确率可达75%。随着技术的发展，将来非侵入性试验可能可以替代肝活检诊断肝纤维化。

　　（五）肝癌的血清标记物进展

　　AFP是目前使用最广泛的肝癌血清标记物，但是它的敏感性和特异性有限。约有超过20%的肝癌病人AFP不升高，而在一些肝炎病人中AFP也会升高。现有一些新的肝癌血清标记物将来可能可以用于临床。

　　1．AFP和AFP-L3

　　AFP作为肝细胞癌的标记物已经有数十年的时间了，根据一些文献统计，它的正常值为20ng/ml以下时，敏感性在40~65%，特异性在76~96%。AFP根据它糖链的不同，可分为AFP-L1，AFP-L2，AFP-L3三种。AFP-L3比总AFP对肝癌的特异性更高，它的敏感性为36~96%，特异性为89~94%。

　　2．去γ羧基凝血酶原（DCP）

　　DCP是个由肿瘤细胞产生的异常凝血酶原，在肝炎中不会产生DCP，因此它比AFP特异性更高。它的正常值为40mAU/ml以下。它的敏感性为28~89%，特异性为87~96%。如果DCP联用AFP-L3可以提高诊断肝癌的特异性和敏感性。

　　3．转化生长因子β1（Transforming Growth Factor-β1）

　　转化生长因子β1（TGF β1）是个多功能因子，它在肝癌病人中会过度表达。研究认为，以800pg/ml为正常上限，TGF β1诊断肝癌的特异性大于95%，敏感性为68%，优于AFP，而且在25%AFP阴性的肝癌病人中，TGF β1会升高。

　　4．α-L-岩藻糖苷酶（α-L-Fucosidase)

　　α-L-岩藻糖苷酶（ALF）的正常上限值为870nmol/ml时，它诊断肝癌的敏感性为82%，特异性为71%。另外还发现，如果患者的ALF大于700nmol/ml时，经过半年的B超随访，有85%的患者会发生肝癌。

　　5．Glypican-3（GPC3）

　　GPC3和多种生长因子有相互作用，它能调控多种生长因子的活性。它在40~53%的肝细胞癌的病人中显著增高，和其它标记物（AFP，DCP）联用可以使诊断肝癌的敏感性从50%提高到72%。

　　6．Golgi Protein 73

　　Golgi Protein 73在一项研究中显示，其敏感性为69%，特异性为75%。与AFP相比，在早期肝癌的诊断中其敏感性为62%，而AFP的敏感性仅为25%。

　　7．肝细胞生长因子（HGF）

　　在慢性丙肝的研究中，合并肝癌病人的HGF水平显著高于没有肝癌的病人。令人感兴趣的是，HGF血清浓度大于0.6ng/ml的肝癌病人的AFP和DCP均不高。

　　8．胰岛素样生长因子1（Insulin Growth Factor 1）

胰岛素样生长因子1（IGF1）能调节细胞从细胞周期的G1期进入S期。在研究中发现，70%的肝癌病人的IGF1显著降低。

　　9．血管内皮生长因子（VEGF）

　　在肝癌病人中，VEGF较对照组显著增高，如果VEGF大于245pg/ml，那么病人的无病生存率显著降低。

　　目前主要还是用AFP，AFP-L3，DCP作为诊断肝癌的主要血清标记物，其它血清标记物因为检测的方法不同，研究的数据有限，诊断价值还有待进一步的研究证实。如能利用这些方法早期诊断小肝癌，对提高肝癌患者的生存率意义重大。